Delphi

La identificación de diferentes tipos de célula por la morfología obtenida en Microscopia Electrónica requiere de un conocimiento de nivel experto y suele ser un proceso que exige mucho tiempo. Con la microscopía correlativa resulta mucho más sencillo localizar diferentes tipos de célula en base a técnicas de inmuno identificación exactas y confiables. Utilizando este abordaje se puede mapear rápidamente grandes áreas y hacer zoom sobre las estructuras de interés.

La microscopia de correlación óptica y electrónica (CLEM) combina la microscopía electrónica con la de fluorescencia. Se trata de una técnica potente por su capacidad de combinar información estructural y funcional. Sin embargo, la complejidad de su procedimiento ha limitado su aplicación a gran escala. Actualmente la técnica CLEM se aplica utilizando dos microscopios distintos, lo que presenta varias dificultades:

• La región de interés es difícil de recuperar
• La transferencia puede provocar alteraciones en la muestra
• El paso de un microscopio a otro toma mucho tiempo
• La exactitud de la correlación está limitada a la precisión mecánica
• La superposición de las imágenes es subjetiva

El modelo Delphi es una solución integral para la microscopía correlativa, ya que combina un microscopio electrónico de mesada con un microscopio de fluorescencia invertido. Esta integración permite trabajar con microscopía correlativa sin las dificultades asociadas con esta técnica.

El Delphi no sólo integra en términos de hardware, sino que también utiliza un único software que permite controlar los dos modos de captura de imágenes. Su diseño implica una importante simplificación del procedimiento empleado para correlacionar: con colocar la muestra una sola vez en el microscopio, ya se puede obtener imágenes tanto electrónicas como de fluorescencia. Además, la interfaz intuitiva del software acerca la microscopía correlativa a cualquier usuario con un mínimo de entrenamiento, y permite concentrarse de inmediato en analizar los resultados.

El Delphi soporta una gran variedad de tipos de muestra, ya que permite montar diferentes portamuestras (el estándar es un cubre objetos de 14x14mm). Este cubre objetos se posiciona fácilmente utilizando los adhesivos conductores de carbón ya presentes en el portamuestra. Ya se trate de células en cultivo o de secciones finas de tejido, la colocación de muestras es sencilla y rápida.

El Delphi aumenta notablemente la confiabilidad del procedimiento de correlación brindando una superposición precisa y objetiva. Utiliza un procedimiento de alineación totalmente automatizado e independiente tanto del usuario como de la muestra.

La clave de este procedimiento es el principio físico de catodoluminiscencia. Se genera luz donde el haz de electrones impacta el cubre objeto de vidrio. Esta luz es captada por la cámara del microscopio de fluorescencia y opera como marcador de referencia provisorio. Una red de marcadores de referencia de este tipo permite producir una superposición de imágenes perfecta. Esto significa que cualquier usuario es capaz de obtener resultados confiables.

Ventajas de la microscopia de correlación óptica y electrónica

• Combina función y estructura: Para entender la naturaleza compleja de muchos sistemas biológicos es importante tener un buen conocimiento tanto de su estructura como de su función. La microscopia de correlación óptica y electrónica brinda al usuario estas respuestas de forma rápida y sencilla.
• Identificación multicolor de la microscopía electrónica: Se obtiene una mayor flexibilidad utilizando fluoróforos en lugar de la tradicional mediante partículas de oro soportadas sobre anticuerpos para rotular las estructuras de interés. Los fluoróforos son más fáciles de utilizar, pueden ser genéticamente codificados, y permiten usar tantos rótulos como se necesiten.
• Proporciona el contexto de la microscopía electrónica a la fluorescencia: utilizando CLEM, se aprovecha la potencia y versatilidad de la microscopia de fluorescencia para adquirir imágenes. CLEM permite posicionar fácilmente estas imágenes en un contexto estructural.
• Validación de datos: Comparando los datos obtenidos por microscopía óptica con los obtenidos por microscopía electrónica, el usuario se asegura de estar observando las estructuras de interés.

Ventajas de la microscopía correlativa integrada

• Toma de imagines continua: Con una configuración integrada, no se necesita recuperar la región de interés. El cambio de modalidad de toma de imágenes es continuo y sin saltos.
• Superposición perfecta: Sólo los sistemas integrados son capaces de ofrecer una superposición perfecta y objetiva.
• Resultados confiables: Eliminando el paso de un microscopio a otro, se reduce notablemente el riesgo de dañar o alterar la muestra.
• Mayor rendimiento: Al reducirse el tiempo implicado en el procedimiento de correlación, el usuario puede realizar más experimentos para obtener resultados cuantitativos.

Fácil y rápido

• Solución integral para microscopía correlativa
• Integración de hardware y software
• Menos de tres minutos desde la colocación de la muestra hasta la toma de imágenes

Agregar contexto

• Superposición independiente tanto del usuario como de la muestra
• Algoritmo único con resultados perfectos
• Procedimiento de superposición totalmente automatizado

Diseño compacto

• Puede colocarse en cualquier laboratorio
• No requiere infraestructura o equipamiento extra
• Instalación sencilla (“plug-and-play”) sin necesidad de calibración in situ

Tiempo de carga de muestra	Para navegación con la cámara < 5 seg. Para SEM/fluorescencia < 60 seg.
Tamaño de muestra	Hasta 8 mm de diámetro
Muestreo	Posicionamiento (X,Y) y foco accionado por motores y controlado por computadora
Consumo	700 W a máxima potencia
Cámara	Cámara de navegación a color con modos de campo brillante y oscuro y aumento de 20 – 120x
Lentes objetivo	40x, 0.95NA, planas acromáticas
Resolución	290 a 550 nm en emisión
Iluminación	Fuente de excitación de cuatro canales en estado sólido (LED) con control digital de encendido y apagado y de intensidad. Excitación a 395, 485, 575, y 650 nm
Filtros	Filtros multibanda en Configuración “Pinkel” optimizada para DAPI, FITC,TRITC, Cy5 y otras fluoróforos
Cámara	Cámara CMOS de grado científico de 2048 x 2048 píxeles (tamaño de píxel: 6,5 μm) y con una eficiencia cuántica de de 60% a 600 nm con al menos 40% QE en el rango de 420 – 800 nm
Fuente	Fuente de hexaboruro de cerio (CeB6) de larga duración y alto brillo
Aceleración	Rango de voltaje ajustable entre 4,8 kV y 10 kV
Aumento	20 – 130.000x
Resolución	≤ 14 nm
Detector	Detector de electrones dispersados de alta sensibilidad
Formatos de imagen	OME-TIFF, HDF5
Almacenamiento	Local, en memoria USB o en la red de trabajo
Licencia	Open-source GPLv.2
Módulo de toma de imágenes	350 mm (ancho) x 600 mm (profundidad) x 650 mm (altura), sin contra las pantallas y la bomba
Monitor	Monitor de 24” montado con una PC y un enrutador de red